H9 人胚胎幹細胞/STR鑒定（無飼養(yang) 層）特性

1） 來源：人胚胎幹細胞

2） 形態：貼壁，呈克隆狀

3） 含量：>1x10⁶ 個(ge) /mL
4） 汙染：支原體(ti) 、細菌、酵母和真菌檢測為(wei) 陰性
5） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運輸和保存

可選擇幹冰運輸及發送複蘇存活細胞方式

（1）幹冰運輸，收到後立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接複蘇；

（2）存活細胞，收到後應繼續生長，傳(chuan) 代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體(ti) 操作見細胞培養(yang) 步驟。

（3）收到細胞後請拍照，3天內(nei) 如果發現汙染，請及時拍照與(yu) 我們(men) 聯係。
 
細胞用途：僅(jin) 供科研使用。
                       
細胞接收後的處理：
1） 收到細胞後，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發給我們(men) 。
2） 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態，酒精消毒瓶壁並將T25瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 約2-3h。
3） 將T25瓶中的細胞培養(yang) 基離心後，去上清，添加6ml*培養(yang) 基，加入新的T25瓶中繼續培養(yang) 。
4)   如果細胞長滿80%請及時進行細胞傳(chuan) 代.
 H9 人胚胎幹細胞（無飼養(yang) 層）/STR鑒定

用 mTeSR1 培養(yang) 人胚胎幹細胞（hESC）和人 iPS 細胞（hiPS）

1. 試劑和材料

mTeSRTM1 培養(yang) 基試劑盒（產(chan) 品號#85850）包括：

所需的其他試劑和材料

2. 試劑的製備

2.1 mTeSR1 的製備
2.1.1 在室溫 (15 - 25°C) 下或冰箱內(nei) (2 - 8°C) 過夜解凍 mTeSR
™1 5X 添加物（成分編號 #05852）。 如需要，可在無菌條件下將 5X 添加物分裝為(wei) 適量的工作等份，並在 -20°C 下凍存。冷凍的分量須在 3 個(ge) 月內(nei) 用完。解凍後的分量應在 1 天內(nei) 製備成*的 mTeSR™1 培養(yang) 基。請勿在解凍後再次冷凍。
2.1.2 在無菌條件下將 100 mL 的 5X 添加物全部解凍後加入到 400 mL 的基礎培養(yang) 基中，形成總共 500 mL 的容量。充分混勻。*的 mTeSR™1 培養(yang) 基 在(2 - 8°C) 下儲(chu) 存時可維持穩定狀態多 2 周，或在-20°C 下冷凍時可維持穩定狀態多 6 個(ge) 月。在室溫(15 - 25°C) 下或冰箱內(nei) (2 - 8°C) 過夜解凍冷凍的培養(yang) 基，不要長時間放在 37°C 水浴內(nei) 加熱培養(yang) 液。
如果在無菌條件下製備，*的 mTeSR™1 培養(yang) 基可直接使用，但如需要， 也可使用 0.2 µm 的低蛋白結合過濾器過濾培養(yang) 基。

2.2 Matrigel 工作液配製和包被

應分裝和冷凍保存 BD Matrigel™ hESC-qualified matrix（BD 產(chan) 品號
#354277）。有關(guan) 分裝的完整說明和建議，請查閱與(yu) BD Matrigel™ 同時提供的產(chan) 品說明書(shu) 。分裝後的小包裝可在-70°C 下多儲(chu) 存 6 個(ge) 月。
將一份BD Matrigel™ 加入到25 mL 的DMEM/F12 中，這足以包被四個(ge) 6 孔培養(yang) 板（1 mL／孔）或三個(ge) 100 mm 培養(yang) 皿（8 mL／培養(yang) 皿）。
（1） 將 25 mL 的稀釋培養(yang) 基（DMEM/F12；產(chan) 品號#11330 ）分裝入離心管放在冰上。
（2） 將一份分裝後的 BD Matrigel™自-70°C 取出 ，在冰上解凍，直到成為(wei) 液體(ti) ，然後將解凍後的 BD Matrigel™ 加入到冷稀釋培養(yang) 基（在 50
mL 的試管中）中，充分混勻。如需要，可用冷培養(yang) 基衝(chong) 洗 EP 管。
（3） 立即用稀釋後的 BD Matrigel™ 溶液包被組織培養(yang) 板。對於(yu) 6 孔培養(yang) 板，每個(ge) 孔使用 1 mL 稀釋後的 BD Matrigel™；對於(yu) 100 mm 培養(yang) 板， 每個(ge) 培養(yang) 板使用 8 mL 稀釋後的 BD Matrigel™。旋動培養(yang) 板，以使 BD
Matrigel™ 溶液均勻地分布在表麵上。
要包被其他尺寸的組織培養(yang) 皿，則按照需要包被的培養(yang) 皿的表麵積決(jue) 定稀釋後的 BD Matrigel™用量。
（4） 使用前，包被的培養(yang) 板應放在培養(yang) 箱(37°C) 下至少 1 個(ge) 小時。請勿讓培養(yang) 板脫水。在培養(yang) 板可供使用之前，請勿移除 BD Matrigel™ 溶液。
如果不立即使用，培養(yang) 板必須密封，以防止脫水（如利用 Parafilm®）。包被後的培養(yang) 板可在 2 - 8°C 下多儲(chu) 存 7 天。
如果 BD Matrigel™溶液並未*覆蓋表麵，則無法實現*的 hPSC 培養(yang) ；因此，不建議使用含有溶液已蒸發區域的培養(yang) 板。
（5） 輕輕地將培養(yang) 板向一個(ge) 角落傾(qing) 斜，使過剩的 BD Matrigel ™ 溶液匯聚在那個(ge) 角落。用一次性移液管或通過抽取移除溶液。確保移液槍頭不刮到已包被的表麵。立即加入 mTeSR™1 培養(yang) 基和細胞。
如果已將培養(yang) 板在 2 - 8°C 下儲(chu) 存，則在移除 BD Matrigel™溶液之前， 將培養(yang) 板在培養(yang) 箱 (37°C) 下放置 30 分鍾。

2.3 配製 Y27632 溶液

Y27632 粉末溶解在 DPBS 中，配成濃度為(wei) 10mM 的儲(chu) 存液，0.22um 濾膜過濾除菌。分裝後冷凍於(yu) -20°C，6 個(ge) 月內(nei) 使用。
Y27632 提高複蘇和傳(chuan) 代後的克隆形成率，所以隻在複蘇步驟和傳(chuan) 代步驟添加，換液時不添加 。
 

3. 解凍複蘇 hES /hiPS

在開始操作程序之前，將所有試管、加熱後的培養(yang) 基和培養(yang) 板準備好，以確保盡快完成解凍程序。
（1） 快速在 37°C 水浴槽中解凍 hPSC，方法是輕柔持續地搖動冷凍管，直到

隻剩下一個(ge) 小冷凍團。從(cong) 水浴槽中取出冷凍管，用 70% 乙醇擦拭，以進行消毒。
（2） 使用一個(ge) 1 mL 的移液管將冷凍管中的內(nei) 容物轉移至一個(ge) 15 mL 錐形試管中, 過程必須輕柔防止吹散細胞團。
（3） 將 5 - 7 mL 溫暖的 mTeSR™1 逐滴加入試管中，在加入培養(yang) 基的同時輕柔混勻。
（4） 在室溫(15 - 25°C) 下，以 300 x g 離心細胞 5 分鍾。
（5） 吸出培養(yang) 基，使細胞團保持完整。使用一個(ge) 1 mL 的移液管，輕輕地將細胞重新懸浮在 1 - 2 mL 的 mTeSR™1 中，確保維持細胞的團塊狀態。根據終培養(yang) 細胞的液體(ti) 體(ti) 積，加入 ROCK inhibitor Y27632, 終濃度為(wei) 10uM
（6） 輕輕地將培養(yang) 板/皿向一個(ge) 角落傾(qing) 斜，使過剩的 BD Matrigel™ 溶液匯聚在那個(ge) 角落，從(cong) 而從(cong) 已包被的組織培養(yang) 板中移除 BD Matrigel™。使用一次性移液管或通過抽取移除溶液。確保移液槍頭不刮到已包被的表麵。
如果已將培養(yang) 板在 2 - 8°C 下儲(chu) 存，則在移除 BD Matrigel™溶液之前，將培養(yang) 板在培養(yang) 箱 (37°C) 下 放置 30 分鍾。
（7） 將含有細胞聚集體(ti) 的培養(yang) 基轉移至 BD Matrigel™ 包被的培養(yang) 器皿上。一般一支凍存管細胞複蘇到一個(ge) T25 培養(yang) 瓶或 6 孔板中的 2 個(ge) 孔。
（8） 將培養(yang) 板放在 37°C 培養(yang) 箱中，然後快速地左右、前後移動培養(yang) 板，以均勻地將細胞團分布在各個(ge) 孔內(nei) 。在 37°C、5% CO2 和 95% 濕度的條件下培養(yang) 細胞。
（9） 每天更換培養(yang) 基(不需要再添加 Y27632)。在解凍後大約 5 - 7 天內(nei) 檢查可進行傳(chuan) 代的未分化集落（有密集的中心）。
如果在解凍後僅(jin) 觀察到很少的未分化集落，則可能需要隻選擇這些集落進行傳(chuan) 代，並將它們(men) 重新放在新的 BD Matrigel™包被的培養(yang) 板大小相同的孔中。
（10） 每天換液。
 

4. 用 mTeSR1 對 hES/hiPS 進行傳代

在 mTeSR™1 中生長的細胞當集落變得較大、中心變得密集和明亮（對比其邊緣）而相鄰的集落開始融合時，這時可進行傳(chuan) 代。根據接種的細胞團的大小和密度，傳(chuan) 代周期為(wei) 5 天左右。如果太早對集落進行傳(chuan) 代或傳(chuan) 代太過頻繁，則細胞可能吸附不好、產(chan) 量將會(hui) 減少且細
胞可能分化。如果太晚對集落進行傳(chuan) 代，培養(yang) 物將開始顯示分化跡象（特點是細胞類型出現不同的形態）。
（1） 分裝足夠的 mTeSR™1 以傳(chuan) 代細胞。將分裝的 mTeSR™1、溫和分離液（產(chan) 品號#07174）和 DMEM/F-12 加熱至室溫( 25°C 左右)。
（2） 使用顯微鏡觀察確定分化的區域。用氈製粗頭筆或透鏡標誌器在培養(yang) 板底部標記這些區域。如果培養(yang) 物品質優(you) 異，分化的區域不會(hui) 超過培養(yang) 孔的 20%。
（3） 用移液槍頭刮除或抽取，去除分化區域。
（4） 從(cong) hPSC 培養(yang) 物中吸出培養(yang) 基，然後用 DPBS（不含鈣鎂離子）衝(chong) 洗。
（5） 向每個(ge) 培養(yang) 瓶內(nei) 加入溫和分離液(每個(ge) T25 加 3ml)，覆蓋底麵，在室溫下靜置 1 分鍾。

（6） 吸掉溫和分離液，然後用 6ml DMEM/F-12 輕輕的洗滌培養(yang) 皿一次。
（7） 向培養(yang) 瓶內(nei) 加適量 mTeSR™1，並用細胞刮（如 Corning 產(chan) 品號#3010）將細胞集落刮離培養(yang) 瓶底。
（8） 將分離的細胞聚集體(ti) 轉移至一個(ge) 15 mL 錐形試管中，並加入適量 mTeSR
™1 衝(chong) 洗培養(yang) 瓶，以收集殘留的細胞聚集體(ti) 。將衝(chong) 洗液一並收集到 15 mL 離心管內(nei) 。
輕輕吹打細胞聚集體(ti) 2-3 次，調整培養(yang) 基的體(ti) 積，以實現適當的分配。根據終培養(yang) 細胞的液體(ti) 體(ti) 積，加入 ROCK inhibitor Y27632, 終濃度為(wei) 10uM。
（9） 將細胞聚集體(ti) 與(yu) mTeSR™1 接種至新的 BD Matrigel™ 包被的培養(yang) 板上。一般傳(chuan) 代周期為(wei) 5 天左右，傳(chuan) 代比例為(wei) 1：3-1：6。如果集落過於(yu) 密集或過於(yu) 稀疏，則下一次傳(chuan) 代時相應地調整傳(chuan) 代比例。請注意，這些指導基於(yu) 中科院幹細胞庫 hESC H1 和 H9 以及 hiPS DYR0100 和 DYP0530 細胞係的生長特征，在其他不同的細胞係和實驗室之間可能會(hui) 存在差異。
（10） 快速前後和左右多次移動培養(yang) 板，以使細胞分散在各個(ge) 孔的表麵。將培養(yang) 板放在 37°C 培養(yang) 箱中。確保新接種的集落均勻地分布在 BD Matrigel
™包被的培養(yang) 板的整個(ge) 表麵。細胞團分布不均勻有可能導致 細胞分化。
（11） 每天換液。

5. 冷凍 hESC 或 hiPS 細胞

（1） 用顯微鏡觀察需要凍存的培養(yang) 物，確定已分化的區域。用氈製粗頭筆或透鏡標誌器在培養(yang) 板底部標記這些區域。
如果培養(yang) 物品質優(you) 異，分化的區域不會(hui) 超過培養(yang) 孔的 20%。
（2） 用移液槍頭刮除或抽取，去除分化區域。
（3） 從(cong) 培養(yang) 孔中吸出殘留的培養(yang) 基，然後用 DPBS（不含鈣鎂離子）衝(chong) 洗。
（4） 向每個(ge) 培養(yang) 瓶內(nei) 加入溫和分離液(每個(ge) T25 加 3ml)，覆蓋底麵，在室溫下靜置 1 分鍾。
（5） 吸掉溫和分離液，然後用 6ml DMEM/F-12 輕輕的洗滌培養(yang) 皿一次。
（6） 向培養(yang) 瓶內(nei) 每個(ge) 孔內(nei) 加適量 mTeSR™1，並用細胞刮（如 Corning 產(chan) 品號
#3010）將細胞集落刮離培養(yang) 瓶底。
（7） 將分離的細胞聚集體(ti) 轉移至一個(ge) 15 mL 錐形試管中，並加入適量 mTeSR™1 衝(chong) 洗培養(yang) 瓶，以收集殘留的細胞聚集體(ti) 。將衝(chong) 洗液一並收集到 15 mL 離心管內(nei) 。小心地盡量將細胞團保持到大。
（8） 在室溫(15- 25°C) 下，以 300 x g 離心裝有細胞聚集體(ti) 的 15 mL 離心管
5 分鍾。離心細胞時，準備和標記凍存管。
（9） 輕輕地吸出上清液，小心保持細胞團完整。
（10） 使用預冷的(2 -8°C) CryoStor™CS10 輕輕地重新懸浮細胞團，然後將細胞懸液轉移至冷凍管中。
（11） 將冷凍管置於(yu) 程序降溫盒內(nei) （大約-1°C /min）-80°C 冷凍細胞過夜， 然後轉移至液氮長期儲(chu) 存。

18新利苹果客户端密码主要產(chan) 品和技術服務：

一、原代細胞服務
       各類模式哺乳動物的多種原代細胞資源；
       多種人源性正常及腫瘤原代細胞資源；
       原代細胞分離和培養(yang) 相關(guan) 試劑、kit、培養(yang) 基添加劑等；
       原代細胞相關(guan) 技術服務和整體(ti) 實驗外包服務；

二、細胞株/係服務
       細胞株/係培養(yang) 、增殖、凍存和相關(guan) 說明書(shu) ；
       細胞係培養(yang) 過程的技術指導；
       細胞係培養(yang) 基、添加劑、血清及相關(guan) 生長因子、試劑等；

三、iPS細胞
       iPS細胞基礎培養(yang) （有滋養(yang) 層or無滋養(yang) 層在）；
       iPS細胞增殖及冷凍保存；
       iPS基礎培養(yang) 技術實習(xi) ；
       新藥及實驗儀(yi) 器上市前評估；

四、技術外包服務：各類細胞生物學實驗、分子生物學實驗、顯微鏡拍照服務等

五、其他：根據客戶需要定製服務等

• Toledo細胞Toledo 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞
• NCI-H1417細胞NCI-H1417 人小細胞肺癌細胞 STR鑒定
• M-1細胞M-1 小鼠腎集合管細胞(SV40轉化)/STR鑒定
• NCI-H2009細胞NCI-H2009 人肺腺癌細胞/STR鑒定
• AU565細胞AU565 人乳腺癌細胞/STR鑒定
• MUG-Chor1細胞MUG-Chor1 人骶骨脊索瘤細胞/STR鑒定
• U-Ch1細胞U-Ch1 人骶骨脊索瘤細胞/STR鑒定
• HCC1954細胞HCC1954 人乳腺導管癌細胞/STR鑒定
• NCI-H69 人小細胞肺癌細胞 STR鑒定
• KU-19-19 人膀胱移行細胞癌細胞