原代角質形成細胞的分離培養方法

原代細胞在相關(guan) 細胞實驗使用過程中越來越多，人們(men) 不再單單趨於(yu) 使用細胞係進行實驗研究，因為(wei) 細胞係常常由於(yu) 體(ti) 外長期培養(yang) ，而容易丟(diu) 失原有的生物學特性，對藥物處理的反應差距越來越大。
 
原代細胞剛從(cong) 組織中分離開，生物學特性未發生很大變化，仍保留原來的遺傳(chuan) 特性，也接近和反應體(ti) 內(nei) 生長特性，原代細胞的活力和生長狀態都比較好，細胞的純度和基因保留可達到90%以上，適宜用於(yu) 藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究，使用原代細胞進行實驗，可以獲得更準確的研究和數據。
 
為(wei) 了更好的服務於(yu) 廣大科研工作者，鏡像綺點技術人員特提供了角質形成細胞分離的常用方法，技術因人而異僅(jin) 供參考：
 
角質形成細胞是一種不斷分化的複層鱗狀上皮細胞，其分化的終階是形成角蛋白。根據角質形成細胞的發展階段和特點，從(cong) 內(nei) 向外可將其分為(wei) 五層。基底細胞層又稱生發層，棘細胞層，顆粒層，透明層，角質層。
 
角質形成細胞的分化成熟表現為(wei) 從(cong) 基底層到向角質層的逐漸移行。在單一移行過程中，角質形成;細胞的形狀和功能也逐漸發生著變化，從(cong) 單層柱狀上皮的基底層到扁平的細胞核消失的角質層。新生的基底細胞進入棘細胞層，然後上移到顆粒層的上層。細胞組織來源於(yu) 實驗動物的正常皮膚組織，細胞生長狀態為(wei) 貼壁培養(yang) 。
 

需要的實驗試劑：
1.培養(yang) 基1：iCell原代角質細胞培養(yang) 體(ti) 係
4.基礎培養(yang) 基：DMEM/F12
5.緩衝(chong) 液：無菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4
6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ
7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液3：0.1%Ⅰ型膠原酶
9.75%醫用酒精
10.胎牛血清（FBS）
 
實驗器械：
1.培養(yang) 皿
2.T-25細胞培養(yang) 瓶
3.100目不鏽鋼網篩
4.200目不鏽鋼網篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）
 
實驗步驟：
1.新鮮的包皮組織，裝盛於(yu) 含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中，於(yu) 保溫盒中，冰上放置離體(ti) 6h內(nei) 運輸到實驗室進行後續分離。
2.在無菌環境中取出包皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表麵血液後，75%的酒精浸泡100s
3.酒精浸泡組織後快速將組織轉入裝有1×PBS的培養(yang) 皿中震蕩清洗數次以去除酒精，然後用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次後，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1  4度消化過夜（15-18h）。
5.第二天，用2個(ge) 眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離和表皮；
6.分離的表皮用眼科剪剪碎後用消化液3 37度水浴消化1h。
7.消化完成後用移液器充分吹打100次左右，然後用含血清的培養(yang) 基終止消化，過200目不鏽鋼網篩後取濾懸液，轉入15ml離心管中，400g離心10分鍾，離心完成後棄去上清，沉澱用3ml的1×PBS吹打重懸後，400g離心5min離心完成後棄去上清，沉澱用2ml的原代角質細胞培養(yang) 基吹打重懸後，轉入已經裝有2ml培養(yang) 基的T-25培養(yang) 瓶中，將培養(yang) 瓶置於(yu) 37℃的二氧化碳培養(yang) 箱中培養(yang) 。
8.視細胞貼壁情況48-72h後換液去除未貼壁的細胞，之後繼續培養(yang) ，視細胞生長狀況和培養(yang) 基顏色每2-3d換液一次；待細胞貼壁率達到80-90%後，進行常規傳(chuan) 代擴增操作（角質細胞對胰酶不太敏感，消化時間可能會(hui) 增加到10-15分鍾，有時需要配合使用無菌細胞刮鏟進行傳(chuan) 代）。
 
除了上述的細胞分離方法以外，鏡像綺點還有很多關(guan) 於(yu) 其他細胞的分離方法，想要學習(xi) 的小夥(huo) 伴可以來鏡像綺點進行現場學習(xi) ，如果想要其他原代分離培養(yang) 方法，可在購買(mai) 相應的細胞過程中，贈送該細胞的分離方法及培養(yang) 條件，想要了解更多，打電話或谘詢相關(guan) 工作人員。